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EVOLUÇÃO

A Evolução dos testes de imunofluorescencia indireta no diagnóstico das doenças Autoimunes

O diagnóstico laboratorial das doenças autoimunes passou por inúmeras transformações no decorrer dos últimos 50 anos. Históricamente o primeiro teste para o diagnóstico do lúpus eritematoso sistêmico (LES) foi a pesquisa de células LE por Hargreaves. Alguns anos depois, Weller e Coons descreveram a metodologia de imunofluorescência indireta (IFI). Com a aplicação da reação de IFI, os primeiros substratos utilizados para a pesquisa de anticorpos antinucleares (ANA, FAN) foram os cortes de tecidos de fígado de roedores e das técnicas “imprint”.

O grande avanço no diagnóstico, ocorreu com a introdução do substrato células HEp-2,  obtidas de um carcinoma laringeano humano. Em 1979, a empresa Immuno Concepts foi a pioneira na conversão de células de tecidos de roedores para células HEp-2 no uso diagnóstico “in vitro”.

Desde então, inúmeros padrões de reatividade foram relatados. Estes novos achados, quando relacionados com os sintomas clínicos dos pacientes, puderam auxiliar os médicos na caracterização de novas doenças até chegar ao estágio atual de conhecimento.

E novas tecnologias também foram incorporadas para a melhoria da qualidade dos diagnósticos laboratoriais utilizando células HEp-2 como substrato. Recentemente, o pioneirismo da Immuno Concepts, uma das empresas que mais investiram em novas tecnologias lançou um novo substrato, utilizando células HEp-2 geneticamente modificadas, transfectadas com o antígeno SS-A/Ro 60 kDa.

Este novo substrato, denominado HEp-2000®, permitiu um grande avanço na sensibilidade do teste, através da detecção de um novo padrão de reação denominado padrão SS-A/Ro.

Este novo padrão tem ajudado os reumatologistas a diagnosticar mais precocemente doenças como o LES e a SS, uma vez que a sensibilidade do teste permite evidenciar o anti- SS-A diretamente na reação de FAN, como também pela capacidade de diminuir resultados falso negativos, relativamente comuns nas reações de células HEp-2 convencionais.

De acordo com  um trabalho publicado  em 2003 pela conceituada revista “New England Journal of Medicine” Dra. Melissa Arbuckle e colaboradores(3), da Universidade de Oklahoma, EUA,  mostraram que pacientes suspeitos de doenças reumáticas podem sofrer até 4 anos sem um diagnóstico conclusivo, e terem consultado pelo menos 3 médicos diferentes. Também constatou que os anticorpos anti SS-A/Ro estavam presentes no sangue destes pacientes em média 3,4 anos antes do diagnóstico, antes mesmos de reconhecidos marcadores de doença como o anti-Sm. Portanto, um teste de FAN, realizado num substrato de maior sensibilidade pode ajudar os clínicos a diagnosticar a doença mais precocemente, levando o paciente a ter uma melhora da qualidade de vida.

Dezenas de laboratórios brasileiros já comprovaram a qualidade superior e as vantagens deste produto. Uma entidade de credibilidade mundialmente reconhecida ,a CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute em  seu documento I/LA2-A2 vol. 23 nº 13  de 2006,  intitulado “Quality Assurance of Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens: (1)Indirect Fluorescence Assay  for Microscopy...”  cita no capítulo 6.2 a importância  da detecção dos  anticorpos anti SS-A/Ro.

6.2 Antígeno SS-A/Ro

“ O antígeno SS-A/Ro está presente em níveis indetectáveis quando utilizados os substratos provenientes de tecidos de ratos ou camundongos. No entanto, o antígeno SS-A/Ro está presente em quantidades detectáveis nas linhagens de células epitelióides humanas, como HEp-2 ou células KB, quando fixados em acetona.

Bylund e Nakamura tem mostrado a importância da detecção dos auto-anticorpos SS-A/Ro na triagem completa para auto-anticorpos contra antígenos nucleares. A detecção de anti-SS-A requer a implantação e aderência a várias técnicas e recomendações de garantia da qualidade. Recentemente, células HEp-2 transfectadas com proteína humana cDNA de SS-A/Ro 60-kDa hiperexpressados em linhagens de células HEp-2 estão comercialmente disponíveis. As células HEp-

2 transfectadas tem sua sensibilidade para o teste ANA por IFI significativamente aumentada, permitindo a detecção de anticorpos anti-SS-A/Ro específicos nas amostras negativas e equívocas em células não transfectadas. O uso de células HEp-2 transfectadas com SS-A/Ro de 60-kDa é um método muito útil para detecção dos anticorpos anti-SS-A/Ro.

Estas células HEp-2 transfectadas estão disponíveis em fontes comerciais. Outros padrões de coloração específica permanecem inalterados” .

Outra grande instituição,   o College of American Pathologists-CAP,    em seu programa de proficiência laboratorial para pesquisa de anticorpos anti nucleares-ANA,  incluiu a partir de abril de 2007  a possibilidade de liberação do padrão específico SS-A/Ro. 
Isto reforça a importância da detecção do anti SS-A/Ro já nos testes de triagem  de autoanticorpos e a  sua informação em laudo pois com este dado o médico pode concluir com maior precisão e rapidez seu diagnóstico clínico e adotar medidas terapêuticas imediatas com evidentes benefícios ao paciente.

Referências Bibliográficas

1. Fritzler MJ, Miller BJ. Detection of autoantibodies to SS-A/Ro by indirect immunofluorescence using a transfected and overexpressed human 60 kD Ro autoantigen in HEp-2 cells. J.Clin.Lab.Anal. 1995;9:218-224.

2 Arbuckle, M. R., M. T. McClain, et al. Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus. New England Journal of Medicine 2003: 349(16): 1526-1533.

3. Fritzler MJ, Hanson C, Miller J, Eystathioy T. Specificity of autoantibodies to SS-A/Ro on a transfected and overexpressed human 60 kDa Ro autoantigen substrate. J.Clin.Lab.Anal. 2002;16:103-108.

4. NCCLS Quality Assurance of Laboratory Tests for Autoantibodies to Nuclear Antigens: (1) Indirect Fluorescence Assay for Microscopy and (2) Microtiter Enzyme Immunoassay Methods; Approved Guidelines - Second Edition. CLSI I/LA2-A2. 2006;26(13).